DNA-Isolierung und Plasmid-Isolierung
DNA kann leicht aus eukaryotischen und prokaryotischen Zellen isoliert werden. Die Isolierung von DNA stellt den ersten Schritt im Arbeitsprozess einer Gen-Klonierung dar. Die Klonierung eines Gens wiederum ist die Voraussetzung für dessen weitere Analyse, denn durch Klonieren kann eine DNA in reiner Form gewonnen und vermehrt werden.
Einzelne Schritte der Genklonierung im Überblick:
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- Isolation von DNA (genomisch oder cDNA) und Plasmid-DNA
- Schneiden der DNA und des Plasmids mit einem Restriktionsenzym
- Ligation von DNA-Fragmenten mit der Plasmid-DNA
- Transformation von Bakterien mit rekombinantem Plasmid
- Selektion von Bakterienklonen, welche ein Plasmid aufgenommen haben
- Isolierung des Klons mit dem gesuchten DNA-Fragment
Video: Prinzip der Gen-Klonierung (2D-Animation); Ausschnitt aus Video "Klonierung".
DNA Klonierung: Warum?
Klonierung von genomischer DNA
Die totale DNA von Zellen der selben Art wird in Stücke geschnitten und jedes Stück kloniert. Es resultiert eine Sammlung von DNA-Fragmenten, welche das ganze Genom dieser Zellen repräsentieren: die genomische DNA-Bank. Sie eignet sich zur Isolation von Genen (mit Promoter, Introns etc.) und intergenischen DNA-Sequenzen.
Klonierung von cDNA
Die totale mRNA von Zellen der selben Art wird isoliert, in cDNA umgeschrieben und jede cDNA kloniert. Es resultiert eine Sammlung von cDNA-Fragmenten, welche die gesamte mRNA dieser Zellen repräsentieren: die cDNA-Bank. Sie eignet sich zur Isolation von DNA-Abschnitten, welche für Eiweisse kodieren. Da die kodierenden Sequenzen eines Genoms in der Regel nur wenige Prozente der gesamten DNA einer Zelle darstellen, sind cDNA-Banken viel kleiner (weniger Klone) als genomische Banken und eine gewünschte (für Eiweiss kodierende) DNA-Sequenz kann daher mit weniger Aufwand gefunden werden.
DNA-Isolierung
Genomische DNA
Die wichtigsten Schritte:
- Zellen aufbrechen. Physikalisch: z.B. zerstossen der gefrorenen Zellen im Mörser. Chemisch: z.B. Zell-Lyse mit Detergenzien
- Abzentrifugieren von unlöslichen Zelltrümmern
- Reinigen der DNA. Abbau von Proteinen mit Proteasen. Denaturieren und Ausfällen der Proteine mit
- Phenol. Die Nucleinsäuren bleiben in Lösung. Auftrennen von unlöslicher und löslicher Fraktion durch Zentrifugation. Ribonuclease-Behandlung zum Abbau von RNA.
- Anreichern der DNA mittels Ethanol- oder Isopropanolpräzipitation
Details: Chemie der Nukleinsäuren
Video: Prinzip der DNA-Isolierung (2D-Animation); Ausschnitt aus Video "DNA-Isolierung".
Video: Zellkerne isolieren; Ausschnitt aus Video "DNA-Isolierung".
Video: Kernlyse; Ausschnitt aus Video "DNA-Isolierung".
Video: Reinigung mit Phenol; Ausschnitt aus Video "DNA-Isolierung".
Video: DNA-Aggregation; Ausschnitt aus Video "DNA-Isolierung".
cDNA
cDNA (komplementäre DNA) ist ein "Abdruck" der mRNA und entspricht der DNA, welche für eine gesuchte mRNA codiert.
Die wichtigsten Schritte:
- Isolation aller RNAs einer Zelle, in der das gesuchte Gen exprimiert, d.h. das Protein synthetisiert wird.
- Reinigung von mRNA (d.h. Abtrennen von tRNA und rRNA) durch Affinitätschromatographie
- Synthese eines komplementären DNA-Stranges auf der mRNA-Matrize: -> RNA-DNA-Doppelstrang
- Abbau des RNA-Stranges
- Synthese eines komplementären DNA-Stranges auf der DNA-Matrize: -> cDNA (DNA-Doppelstrang)
Vorgehen:
- Isolierung der gesamten zellulären RNA (80% rRNA, 15% tRNA, 5% mRNA)
- Abtrennen einer Fraktion, die hauptsächlich mRNA enthält. Praktisch jedes mRNA-Molekül hat an seinem 3'-Ende eine Abfolge von Adenin-Nucleotiden = Poly (A)-Schwanz. Dieser eröffnet einen sehr bequemen Weg, mRNA von der restlichen Zell-RNA zu trennen. Man bindet Desoxythymidin-Oligonucleotide ("Oligo(dT)") an Zellulose und füllt diese in eine Säule. Lässt man die gesamte Zell-RNA durch diese Säule laufen, bleiben die mRNAs mit ihren Poly (A)-Schwänzen an den Oligonucleotiden "hängen" (Bildung von A-T-Basenpaaren), während die übrigen RNAs die Säule passieren. Nun lässt man einen Puffer niedriger Ionenstärke durch die Säule laufen. Dadurch lösen sich die Poly(A)-Oligo(dT)-Hybride auf, und die gereinigte mRNA fliesst aus der Säule ab.
- cDNA-Synthese. Man gibt kurze Desoxythymidin-Oligonucleotide zu der gereinigten mRNA. Diese hybridisieren mit den Poly (A)-Schwänzen und wirken dann als Primer für die Reverse Transcriptase, ein Enzym aus Retroviren. Mit Hilfe dieses Enzyms werden mRNAs über RNA-DNA-Doppel-stränge zuerst in einzelsträngige DNAs und darauf in doppelsträngige DNAs überschrieben. cDNAs enthalten, wie Gene, die Information zur Bildung von Proteinen, haben aber im Gegensatz zu Genen keine Introns.
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Plasmid-Isolierung
Plasmide sind sich autonom vermehrende Minichromosomen. Sie werden als Vektoren
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Vektoren sind Vehikel für den Transport von DNA in eine Wirtszelle. Durch Einbau eines fremden Gens in den Vektor wird ein rekombinantes DNA-Molekül konstruiert, welches sich in der Wirtszelle replizieren kann.Plasmide
Bakterien (prokaryotische Zellen) beherbergen neben der chromosomalen DNA häufig noch kleine (5 bis 1000 Kilobasenpaare, kb) zirkuläre DNA-Moleküle, Plasmide, die durch die Wirtszelle unabhängig von der genomischen DNA repliziert und transkribiert werden. Medizinisch wichtig sind Resistenzplasmide: Sie enthalten Gene, welche die Wirtszelle gegen Antibiotika unempfindlich machen.
In der Rekombinanten-DNA-Technologie werden künstlich veränderte Plasmide mit den folgenden Elementen eingesetzt:
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Replikations-Ursprung (origin of replication): Er ist für die Vermehrung des Plasmids. Hier beginnt der bakterielle Replikationskomplex mit der bidirektionalen Replikation.
Selektierbare Marker-Gene: Sie ermöglichen das Selektionieren von Bakterienzellen, die das Plasmid aufgenommen haben (z.B. Resistenzgene).
Restriktionsenzym-Schnittstellen: Sie sind wichtig für das Einfügen von fremder DNA. Eine solche Schnittstelle sollte nur einmal in einem Plasmid vorkommen.
Plasmide können nach Bedarf im Labor hergestellt werden. Künstlich veränderte Plasmide enthalten oft sogenannte "Polylinker". Das sind hintereinander geschaltete Schnittstellen für verschiedene Restriktionsenzyme.
Bakteriophagen als Vektoren
Etwas grössere DNA-Segmente können bei der Verwendung des Bakteriophagen Lambda als Vektor kloniert werden. Der Bakteriophage Lambda verfügt über einen sehr wirkungsvollen Mechanismus, um seine aus 48 502 Basenpaaren bestehende DNA in eine Bakterium einzuschleusen.
Das allgemeine Verfahren zur Klonierung von DNA im Bakteriophagen Lambda beruht auf zwei Schlüsselmerkmalen des Bakteriophagen Lambda-Genoms:
- Etwa ein Drittel des Bakteriophagen Lambda-Genoms ist entbehrlich und kann durch Fremd-DNA ersetzt werden.
- DNA wird nur dann in infektiöse Phagenpartikel gepackt, wenn sie eine Länge von 40 000 bis 50 000 Basenpaaren aufweist.
Man hat Bakteriophagen Lambda-Vektoren entwickelt, die leicht in drei Stücke gespalten werden können; zwei davon enthalten essentielle Gene und haben zusammen eine Länge von etwa 30 000 Basenpaaren. Zur Erzeugung "lebensfähiger" Phagenpartikel muss daher zusätzliche DNA zwischen ihnen eingefügt werden. Mit Bakteriophagen Lambda-Vektoren lassen sich DNA-Fragmente mit einer Länge von bis zu 23 000 Basenpaaren klonieren, und ihr Aufbau stellt sicher, dass alle lebensfähigen Phagenpartikel ein Fremd-DNA-Fragment enthalten. Sobald die Fragmente des Bakteriophagen Lambda mit Fremd-DNA-Fragmenten geeigneter Grösse verbunden worden sind, kann die resultierende rekombinierte DNA in Phagenpartikel verpackt werden, indem man sie zu bakteriellen Rohzellextrakten gibt, die alle zum Zusammenbau eines vollständigen Phagen benötigten Proteine enthalten. Man nennt dieses Verfahren in-vitro-Verpackung. Der Bakteriophagenvektor ist nun für die Insertion der rekombinierten DNA in E.coli-Zellen vorbereitet.
Cosmide als Vektoren
Cosmide sind rekombinierte Plasmide, die nützliche Merkmale sowohl der Plasmide als auch des Bakteriophagen in sich vereinigen. Sie sind für die Klonierung noch grösserer DNA-Fragemente entwickelt worden.
Vorgehen:
- Plasmidhaltige Bakterien in einem Flüssig-Medium züchten.
- Bakterien mit Lysozym behandeln, um die Zellwand zu destabilisieren.
- Bakterien mit Detergens lysieren und im alkalischen pH bakterielle DNA und Proteine denaturieren.
- Das Homogenat neutralisieren. Dabei fallen Proteine und bakterielle genomische DNA aus und die bleiben in Lösung.
- Durch Zentrifugation Plasmide vom ausgefällten Material trennen. Die Plasmide mit organischen Lösungsmitteln extrahieren und mit Alkohol ausfällen.
Video: Prinzip der Plasmid-Isolierung (2D-Animation); Ausschnitt aus Video "Plasmid-Isolierung".
Video: Bakterien isolieren; Ausschnitt aus Video "Plasmid-Isolierung".
Video: Plasmid-DNA trennen; Ausschnitt aus Video "Plasmid-Isolierung".
Video: Plasmid-DNA reinigen; Ausschnitt aus Video "Plasmid-Isolierung".
Warum wird die bakterielle genomische DNA denaturiert und die Plasmide bleiben in Lösung?
Lösung
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Lösung Sowohl die bakterielle genomische DNA wie auch die Plasmid-DNA sind ringförmig, unterscheiden sich aber in ihrer Grösse. Bei der Zelllyse wird die bakterielle genomische DNA aufgebrochen respektive linearisiert. Bei der Denaturierung wird die lineare DNA in Einzelstränge aufgetrennt. Die wesentlich kleinere Plasmid-DNA bleibt ringförmig und kann somit nicht denaturiert werden.
Video: Plasmid-DNA trennen; Ausschnitt aus Video "Plasmid-Isolierung".